膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以膝关节软骨磨损、骨质增生、关节隙变窄为主要病理特征的退行性疾病[1]，主要表现为膝关节无力、疼痛和活动受限，严重者会导致关节与肢体畸形[2]。全世界大约有 2.5 亿人患有 KOA[3]。有研究初步估计我国 KOA 患者人数已高达 5 000 万[4]。其高发病率和高致残率，为全社会带来巨大的医疗经济负担。
目前国内外针对 KOA 的治疗主要以西药为主，如非甾体抗炎药、关节内注射透明质酸钠和激素类药物等，但疗效不确切，且会引发多种并发症[5]。灸法以其简、便、效、验的特点，逐渐应用于 KOA 的临床治疗。目前已有多个灸法治疗 KOA 临床疗效的系统评价发表[6-8]，证明了其疗效。动物实验的系统评价可提供关于干预措施安全性和有效性的参考信息，特别在探讨干预措施的作用机理等方面存在不容忽视的意义。但目前尚缺乏基于动物实验的灸法治疗 KOA 的循证研究。因此，本文系统评价灸法治疗 KOA 模型兔的疗效，并探讨可能的作用机制，以明确灸法在 KOA 中的作用。
1 资料与方法
1.1 纳入与排除标准
1.1.1 研究类型
采用随机对照设计的动物实验研究。
1.1.2 研究对象
实验 KOA 模型兔，种类品系、雌雄、月龄、造模方法不限。
1.1.3 干预措施
实验组：仅采用灸法，灸法种类、灸量、疗程、干预时长、选穴等不限；对照组：给予空白或安慰剂对照，或其他阳性治疗药物（如西医常规治疗）。
1.1.4 结局指标
主要结局指标：① Mankin 评分；② 软骨细胞凋亡阳性率；③ 关节液 IL-1β 水平；④ 关节液 TNF-α 水平；⑤ 关节液 NO 含量；⑦ 血清 IL-1β 水平；⑧ 血清 TNF-α 水平；⑨ 血清 NO 含量。
1.1.5 排除标准
① KOA 合并其他基础疾病；② 重复发表或数据雷同的文献；③ 非中、英文文献；④ 关键结局指标数据缺失或无法提取的文献。
1.2 文献检索策略
计算机检索 CNKI、WanFang Data、VIP、CBM、PubMed、EMbase 和 The Cochrane Library 数据库，搜集灸法治疗 KOA 模型兔的动物实验，检索时限均为建库至 2019 年 1 月 31 日。检索采用主题词和自由词相结合的方式进行。中文检索词包括：灸、三伏贴、三九贴、太乙神针、雷火神针、膝骨性关节炎、膝关节退行性关节炎、膝关节退变性关节炎、膝关节退化性关节炎、膝关节退行性变、膝退行性骨关节炎、退行性膝关节骨性关节病、退行性膝关节病、兔等；英文检索词包括：moxibustion、osteoarthritis、arthrosteitis、osteoarthritis of knee、arthrosteitis of knee、rabbit 等。以 PubMed 为例，其具体检索策略见框 1。
图1
1.3 文献筛选与资料提取
由 2 名研究者独立筛选文献、提取资料并交叉核对。如有分歧，则通过讨论或与第三方协商解决。文献筛选时首先阅读文题，在排除明显不相关的文献后，进一步阅读摘要和全文以确定是否纳入。如有需要，通过邮件、电话联系原始研究作者获取未确定但对本研究非常重要的信息。资料提取内容包括：① 纳入研究的基本信息：研究题目、第一作者、发表杂志等；② 动物品种、造模方法和干预措施；③ 偏倚风险评价的关键要素；④ 所关注的结局指标和结果测量数据。
1.4 纳入研究的偏倚风险评价
由 2 名研究者独立评价纳入研究的偏倚风险，并交叉核对结果。偏倚风险评价采用 SYRCLE 动物实验偏倚风险评估工具[9]。
1.5 统计分析
采用 RevMan 5.3 软件进行统计分析。计量资料采用均数差（mean difference，MD）或标准化均数差（standardized mean difference，SMD）为效应分析统计量，各效应量均提供其 95%CI。纳入研究结果间的异质性采用 χ2 检验进行分析（检验水准为 α=0.1），同时结合 I2 定量判断异质性大小。若各研究结果间无统计学异质性，则采用固定效应模型进行 Meta 分析；若各研究结果间存在统计学异质性，则进一步分析异质性来源，在排除明显临床异质性的影响后，采用随机效应模型进行 Meta 分析[10]。Meta 分析的水准设为 α=0.05。明显的临床异质性采用亚组分析或敏感性分析等方法进行处理，或只行描述性分析。
2 结果
2.1 文献筛选流程及结果
初检共获得相关文献 121 篇，经逐层筛选，最终纳入 13 个研究[11-23]。文献筛选流程及结果见图 1。
图1
文献筛选流程及结果
*所检索的数据库及检出文献数具体如下：PubMed（
2.2 纳入研究的基本特征与偏倚风险评价结果
表1
纳入研究的基本特征
表2
纳入研究的偏倚风险评价结果
2.3 Meta 分析结果
2.3.1 Mankin 评分
共纳入 6 个研究[11, 13, 16-18, 22]。随机效应模型 Meta 分析结果显示：灸法能降低 KOA 模型兔的 Mankin 评分［MD=−6.47，95%CI（−7.63，−5.32），P<0.000 01］。
2.3.2 软骨细胞调亡阳性表达率
共纳入 5 个研究[12-15, 18]。固定效应模型 Meta 分析结果显示：灸法可减少 KOA 模型兔软骨细胞凋亡［MD=−22.21，95%CI（−23.22，−21.21），P<0.000 01］。
2.3.3 关节液 IL-1β 水平
共纳入 3 个研究[13, 14, 20]。随机效应模型 Meta 分析结果显示：灸法可降低 KOA 模型兔关节液 IL-1β 水平［SMD=−8.40，95%CI（−15.09，−1.72），P=0.01］。
2.3.4 关节液 TNF-α 水平
共纳入 2 个研究[13, 20]。随机效应模型 Meta 分析结果显示：灸法未降低 KOA 模型兔关节液 TNF-α 水平［SMD=−36.21，95%CI（−102.85，30.43），P=0.29］。
2.3.5 关节液 NO 含量
共纳入 2 个研究[14, 15]。随机效应模型 Meta 分析结果显示：灸法可减少 KOA 模型兔关节液 NO 含量［SMD=−11.03，95%CI（−17.87，−4.19），P=0.002］。
2.3.6 血清 IL-1β 水平
仅纳入 1 个研究[23]，结果显示灸法可降低 KOA 模型兔血清 IL-1β 水平［MD=−19.94，95%CI（−23.61，−16.27），P<0.05］。
2.3.7 血清 NO 含量
仅纳入 1 个研究[21]，结果显示灸法可降低 KOA 模型兔血清 NO 含量［MD=−22.69，95%CI（−28.77，−16.61），P<0.05］。
3 讨论
动物实验目的多是初步验证干预措施的安全性和有效性，指导临床试验方案的制定或修正动物实验设计缺陷[24]。而中医药动物实验一般以观察疗效、验证中医药干预措施的有效性、探究其治疗的作用机制为目的。基于此，本研究从组织形态学、软骨细胞凋亡和炎性细胞因子等 3 个层面进行 Meta 分析，以期从不同层面阐述灸法对 KOA 疗效，同时对其作用机理进行探究。
Mankin 评分是对骨关节炎（osteoarthritis，OA）软骨组织病变的病理学分级，评分越高，提示软骨退变程度越严重[25]。IL-1β 和 TNF-α 是 OA 发生中的关键细胞因子，可促进促炎因子表达，抑制软骨基质合成，加速软骨基质降解，导致软骨细胞的代谢障碍和活力降低，加重软骨退变，从而加速 OA 进展[26-28]。软骨细胞凋亡是 OA 发生的重要环节，在 OA 患者关节软骨中可发现软骨细胞的凋亡远高于正常人，其凋亡率高达 25%～40%[29]。NO 与关节软骨退变的病理生理密切相关，其一方面抑制软骨细胞增殖，另一方面又降解软骨基质，破坏软骨结构[30]。因此，本研究对以上指标进行 Meta 分析，以期揭示灸法对于 KOA 的作用机制。本研究结果显示，灸法治疗组的 Mankin 评分、软骨细胞凋亡率、IL-1β 含量及 NO 水平均低于对照组，提示灸法可降低关节液和血清中炎性因子 IL-1β 含量，改善关节局部的内环境，并且从 NO 途径抑制软骨细胞凋亡；此外，灸法还对软骨细胞的凋亡有调控作用。故灸法可能能够防治 KOA，延缓软骨退变，但纳入研究的样本量均较小，结果可能存在偏倚。本研究结果显示两组关节液 TNF-α 水平差异无统计学意义，可能因为样本量较小或结果数据测量方法不一所导致。
本研究的局限性：① 纳入研究存在较高的偏倚风险，降低了结论的可靠性；② 研究样本量均较小，可能高估灸法对 KOA 的疗效；③ 仅纳入中、英文研究，有语言偏倚和发表偏倚的可能性；④ 由于纳入研究在动物造模标准及方法、实验条件及规范程度、施灸种类及穴位选择、干预时长、结局指标测量方法等存在较大差异，导致研究间存在较大异质性，但受研究数量限制，无法进行亚组分析，降低了研究结果的动物模型参考价值。
综上所述，当前证据表明，灸法能够改善模型兔关节软骨损伤，加强软骨细胞活性，抑制炎症反应，抑制软骨细胞凋亡。受纳入研究数量和质量的限制，上述结论尚待更多高质量研究予以验证。
膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以膝关节软骨磨损、骨质增生、关节隙变窄为主要病理特征的退行性疾病[1]，主要表现为膝关节无力、疼痛和活动受限，严重者会导致关节与肢体畸形[2]。全世界大约有 2.5 亿人患有 KOA[3]。有研究初步估计我国 KOA 患者人数已高达 5 000 万[4]。其高发病率和高致残率，为全社会带来巨大的医疗经济负担。
目前国内外针对 KOA 的治疗主要以西药为主，如非甾体抗炎药、关节内注射透明质酸钠和激素类药物等，但疗效不确切，且会引发多种并发症[5]。灸法以其简、便、效、验的特点，逐渐应用于 KOA 的临床治疗。目前已有多个灸法治疗 KOA 临床疗效的系统评价发表[6-8]，证明了其疗效。动物实验的系统评价可提供关于干预措施安全性和有效性的参考信息，特别在探讨干预措施的作用机理等方面存在不容忽视的意义。但目前尚缺乏基于动物实验的灸法治疗 KOA 的循证研究。因此，本文系统评价灸法治疗 KOA 模型兔的疗效，并探讨可能的作用机制，以明确灸法在 KOA 中的作用。
1 资料与方法
1.1 纳入与排除标准
1.1.1 研究类型
采用随机对照设计的动物实验研究。
1.1.2 研究对象
实验 KOA 模型兔，种类品系、雌雄、月龄、造模方法不限。
1.1.3 干预措施
实验组：仅采用灸法，灸法种类、灸量、疗程、干预时长、选穴等不限；对照组：给予空白或安慰剂对照，或其他阳性治疗药物（如西医常规治疗）。
1.1.4 结局指标
主要结局指标：① Mankin 评分；② 软骨细胞凋亡阳性率；③ 关节液 IL-1β 水平；④ 关节液 TNF-α 水平；⑤ 关节液 NO 含量；⑦ 血清 IL-1β 水平；⑧ 血清 TNF-α 水平；⑨ 血清 NO 含量。
1.1.5 排除标准
① KOA 合并其他基础疾病；② 重复发表或数据雷同的文献；③ 非中、英文文献；④ 关键结局指标数据缺失或无法提取的文献。
1.2 文献检索策略
计算机检索 CNKI、WanFang Data、VIP、CBM、PubMed、EMbase 和 The Cochrane Library 数据库，搜集灸法治疗 KOA 模型兔的动物实验，检索时限均为建库至 2019 年 1 月 31 日。检索采用主题词和自由词相结合的方式进行。中文检索词包括：灸、三伏贴、三九贴、太乙神针、雷火神针、膝骨性关节炎、膝关节退行性关节炎、膝关节退变性关节炎、膝关节退化性关节炎、膝关节退行性变、膝退行性骨关节炎、退行性膝关节骨性关节病、退行性膝关节病、兔等；英文检索词包括：moxibustion、osteoarthritis、arthrosteitis、osteoarthritis of knee、arthrosteitis of knee、rabbit 等。以 PubMed 为例，其具体检索策略见框 1。
图1
1.3 文献筛选与资料提取
由 2 名研究者独立筛选文献、提取资料并交叉核对。如有分歧，则通过讨论或与第三方协商解决。文献筛选时首先阅读文题，在排除明显不相关的文献后，进一步阅读摘要和全文以确定是否纳入。如有需要，通过邮件、电话联系原始研究作者获取未确定但对本研究非常重要的信息。资料提取内容包括：① 纳入研究的基本信息：研究题目、第一作者、发表杂志等；② 动物品种、造模方法和干预措施；③ 偏倚风险评价的关键要素；④ 所关注的结局指标和结果测量数据。
1.4 纳入研究的偏倚风险评价
由 2 名研究者独立评价纳入研究的偏倚风险，并交叉核对结果。偏倚风险评价采用 SYRCLE 动物实验偏倚风险评估工具[9]。
1.5 统计分析
采用 RevMan 5.3 软件进行统计分析。计量资料采用均数差（mean difference，MD）或标准化均数差（standardized mean difference，SMD）为效应分析统计量，各效应量均提供其 95%CI。纳入研究结果间的异质性采用 χ2 检验进行分析（检验水准为 α=0.1），同时结合 I2 定量判断异质性大小。若各研究结果间无统计学异质性，则采用固定效应模型进行 Meta 分析；若各研究结果间存在统计学异质性，则进一步分析异质性来源，在排除明显临床异质性的影响后，采用随机效应模型进行 Meta 分析[10]。Meta 分析的水准设为 α=0.05。明显的临床异质性采用亚组分析或敏感性分析等方法进行处理，或只行描述性分析。
2 结果
2.1 文献筛选流程及结果
初检共获得相关文献 121 篇，经逐层筛选，最终纳入 13 个研究[11-23]。文献筛选流程及结果见图 1。
图1
文献筛选流程及结果
*所检索的数据库及检出文献数具体如下：PubMed（
2.2 纳入研究的基本特征与偏倚风险评价结果
表1
纳入研究的基本特征
表2
纳入研究的偏倚风险评价结果
2.3 Meta 分析结果
2.3.1 Mankin 评分
共纳入 6 个研究[11, 13, 16-18, 22]。随机效应模型 Meta 分析结果显示：灸法能降低 KOA 模型兔的 Mankin 评分［MD=−6.47，95%CI（−7.63，−5.32），P<0.000 01］。
2.3.2 软骨细胞调亡阳性表达率
共纳入 5 个研究[12-15, 18]。固定效应模型 Meta 分析结果显示：灸法可减少 KOA 模型兔软骨细胞凋亡［MD=−22.21，95%CI（−23.22，−21.21），P<0.000 01］。
2.3.3 关节液 IL-1β 水平
共纳入 3 个研究[13, 14, 20]。随机效应模型 Meta 分析结果显示：灸法可降低 KOA 模型兔关节液 IL-1β 水平［SMD=−8.40，95%CI（−15.09，−1.72），P=0.01］。
2.3.4 关节液 TNF-α 水平
共纳入 2 个研究[13, 20]。随机效应模型 Meta 分析结果显示：灸法未降低 KOA 模型兔关节液 TNF-α 水平［SMD=−36.21，95%CI（−102.85，30.43），P=0.29］。
2.3.5 关节液 NO 含量
共纳入 2 个研究[14, 15]。随机效应模型 Meta 分析结果显示：灸法可减少 KOA 模型兔关节液 NO 含量［SMD=−11.03，95%CI（−17.87，−4.19），P=0.002］。
2.3.6 血清 IL-1β 水平
仅纳入 1 个研究[23]，结果显示灸法可降低 KOA 模型兔血清 IL-1β 水平［MD=−19.94，95%CI（−23.61，−16.27），P<0.05］。
2.3.7 血清 NO 含量
仅纳入 1 个研究[21]，结果显示灸法可降低 KOA 模型兔血清 NO 含量［MD=−22.69，95%CI（−28.77，−16.61），P<0.05］。
3 讨论
动物实验目的多是初步验证干预措施的安全性和有效性，指导临床试验方案的制定或修正动物实验设计缺陷[24]。而中医药动物实验一般以观察疗效、验证中医药干预措施的有效性、探究其治疗的作用机制为目的。基于此，本研究从组织形态学、软骨细胞凋亡和炎性细胞因子等 3 个层面进行 Meta 分析，以期从不同层面阐述灸法对 KOA 疗效，同时对其作用机理进行探究。
Mankin 评分是对骨关节炎（osteoarthritis，OA）软骨组织病变的病理学分级，评分越高，提示软骨退变程度越严重[25]。IL-1β 和 TNF-α 是 OA 发生中的关键细胞因子，可促进促炎因子表达，抑制软骨基质合成，加速软骨基质降解，导致软骨细胞的代谢障碍和活力降低，加重软骨退变，从而加速 OA 进展[26-28]。软骨细胞凋亡是 OA 发生的重要环节，在 OA 患者关节软骨中可发现软骨细胞的凋亡远高于正常人，其凋亡率高达 25%～40%[29]。NO 与关节软骨退变的病理生理密切相关，其一方面抑制软骨细胞增殖，另一方面又降解软骨基质，破坏软骨结构[30]。因此，本研究对以上指标进行 Meta 分析，以期揭示灸法对于 KOA 的作用机制。本研究结果显示，灸法治疗组的 Mankin 评分、软骨细胞凋亡率、IL-1β 含量及 NO 水平均低于对照组，提示灸法可降低关节液和血清中炎性因子 IL-1β 含量，改善关节局部的内环境，并且从 NO 途径抑制软骨细胞凋亡；此外，灸法还对软骨细胞的凋亡有调控作用。故灸法可能能够防治 KOA，延缓软骨退变，但纳入研究的样本量均较小，结果可能存在偏倚。本研究结果显示两组关节液 TNF-α 水平差异无统计学意义，可能因为样本量较小或结果数据测量方法不一所导致。
本研究的局限性：① 纳入研究存在较高的偏倚风险，降低了结论的可靠性；② 研究样本量均较小，可能高估灸法对 KOA 的疗效；③ 仅纳入中、英文研究，有语言偏倚和发表偏倚的可能性；④ 由于纳入研究在动物造模标准及方法、实验条件及规范程度、施灸种类及穴位选择、干预时长、结局指标测量方法等存在较大差异，导致研究间存在较大异质性，但受研究数量限制，无法进行亚组分析，降低了研究结果的动物模型参考价值。
综上所述，当前证据表明，灸法能够改善模型兔关节软骨损伤，加强软骨细胞活性，抑制炎症反应，抑制软骨细胞凋亡。受纳入研究数量和质量的限制，上述结论尚待更多高质量研究予以验证。
